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文献资料
桑黄子实体两种新多糖的分离纯化与结构研究
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1017
窦茜茜1, 2 ,凌沛学1 ,王洪权23
(1. 山东省药学科学院,山东济南 250101;
2. 军事医学科学院微生物流行病研究所,北京 100071)
摘 要: 目的 从桑黄子实体中分离具有抗肿瘤活性的多糖成分,并进行结构分析。方法 热水浸提法提取桑黄子实体中的粗多糖,经醇沉、冷冻干燥、离子交换层析、凝胶层析和超滤,得到纯度较高的多糖,通过HPLC、IR、1H2NMR、13 C2NMR、高碘酸氧化及Smith降解确定2种多糖的相对分子质量、组成及结构。结果 分离纯化得到相对分子质量分别为14. 2 ×103 , 22. 2 ×103 的多糖PL2A及蛋白聚糖PL2B,两者都是结构复杂的中性杂多糖。PL2B中,糖占71% ,蛋白质占7%; PL2A, PL2B均含大量葡萄糖及少量甘露糖, PL2B中还有部分鼠李糖; PL2B所含氨基酸包括缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸。结论 多糖PL2A与蛋白聚糖PL2B为首次从桑黄子实体中提取到的多糖成分。
关键词: 桑黄; 多糖; 纯化; 结构
中图分类号: R284. 2 文献标识码: A 文章编号: 16722979X (2009) 0720021205
桑黄( Phellinus linteus ) 属担子菌亚门(B asidiom ycotina) ,层菌纲(Hym enom y cetes) ,多孔菌目(Aphyllophorales) ,多孔菌科( Polyporaceae) , 针层孔菌属( Phellinus) , 主要寄生在桑树树干上[ 1 ] 。现泛指同属的一些种类,东亚地区将其拉丁名称为Phellinus lin2 teus (Berk &M. A. Curtis) Teng,也有些学者将产自中国的桑黄归为火木层孔菌或针层孔菌( Phellinus ignia2 rius) [ 2 ] ,或鲍氏层孔菌( Phellinus baum ii Pilat) [ 3 ] 。食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期 21
目前不少研究表明,桑黄子实体的水提取物能明显抑制肿瘤生长,尤其对小鼠肉瘤S180 有较强的的抑制作用[ 4 ] 。后来研究证明桑黄中的抗肿瘤活性成分主要为多糖类物质[ 5 ] 。对其活性机制的研究表明,桑黄多糖可以明显延长植入黑素瘤B16F10小鼠的寿命,减少黑素瘤B16F10的肺转移率[ 6 ] 。桑黄多糖能通过增强巨噬细胞、自然杀伤细胞及B细胞的活性来抑制肿瘤的生长和转移,既是免疫增强剂,又可作为肿瘤细胞附着的直接抑制剂[ 7211 ] 。12-31
1 材料
1. 1 主要仪器
UV21601 PC紫外可见分光光度计(日本岛津) ;十万分之一BP211D电子天平( Sartorious) ; YB22真空恒温干燥箱(天津药典标准仪器厂) ; FD21 冷冻干燥机(北京博医康技术公司) ; LABORATA 4000 旋转蒸发仪( Heidolph ) ; ASV23023 电子高压消毒锅(日本SAKURA) ;Vivaflow200超滤包(德国V IVASCIENCE) ; 蠕动泵(美国M ILL IPORE) ;Waters2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器、410示差检测器(Waters) ; CAP2 CELL PAK NH2 UG80色谱柱(日本资生堂) ; TSK gel G3000 PW XL色谱柱(日本TOSOH) ; Diamonsil TM C18 色谱柱(迪马公司) ; FTS265A 红外光谱仪(美国B io2 Rad) ; UN ITY INOVA 600 超导核磁共振谱仪(美国Varian)
1. 2 试剂
乙二氨基乙基纤维素(DEAE2Cellulose, Sigma) ;葡聚糖凝胶( Sephadex, G250, Pharmacia) ;右旋糖苷分子质量标准对照品(中国药品生物制品检定所) ;三氟乙酸(ACROS) ; 对二甲氨基偶氮苯磺酰氯(DABS Cl, Fluka) , Folin2酚乙试剂,牛血清蛋白( Sigma) ,其他试剂均为国产分析纯。
1. 3 原料
桑黄子实体原料来自东南亚,批号20041201。
2 方法
2. 1 粗多糖的提取
桑黄子实体原料,粉碎后取粉末200 g于3 L沸水回流8 h,重复3次,将滤液合并后浓缩,冷冻干燥,所得产物即水提粗多糖。加少量水溶解,加5倍体积的,95 %乙醇于4 ℃放置24 h,离心收集沉淀,即得醇沉粗多糖[ 6 ] 。
2. 2 离子交换层析和凝胶层析
DEAE2纤维素柱( 4 cm ×60 cm) 经5 mmol PBS (pH 7. 7)平衡12 h,醇沉粗多糖溶于少量缓冲液后上样。先用同种缓冲液(500 mL)以5 mL /min流速洗涤未与阴离子交换剂结合部分,后用0. 1 ~1. 0 mol/L NaCl溶于缓冲液制成的梯度洗脱液(共1 000 mL)洗脱与交换剂结合部分,最后以1. 0 mol/L NaCl2缓冲液(500 mL)洗脱,每10 mL 收集产物,硫酸苯酚法呈阳性部分分别合并,超滤除盐,冻干[ 11 ] 。
Sephadex G250凝胶柱层析(1. 6 cm ×40 cm)进一步纯化产品,凝胶柱经20 mmol NaCl溶液平衡后,分别将适量冻干产品溶于该流动相后上样,按0. 2 mL / min洗脱,硫酸苯酚法呈阳性部分合并,超滤除盐,冻干[ 12 ] 。
2. 3 高效液相凝胶色谱法测定多糖相对分子质量选用相对分子质量(Mr ) 180, 4 600, 7 100, 10 000, 21 400, 2 000 000的右旋糖苷作为对照品。色谱条件如下:色谱柱TSK gel, G3000 PW XL,柱温40 ℃,流动相为20 mmol/L HAc2NaAc缓冲液(pH 5. 7) ,流速0. 4 mL /min,检测器为R I[ 13 ] 。2011-1-1
2. 4 糖含量及蛋白质含量确定
硫酸苯酚法测定样品中总糖含量[ 14 ] ,二硝基水杨酸(DNS)法测定其中还原糖含量[ 15 ] , Lowry法测定结合多糖中的蛋白质含量[ 16 ] 。
2. 5 HPLC法确定单糖及氨基酸组成
多糖充分水解后, HPLC测定其单糖及氨基酸组成。纯化多糖3 mg加2 mol/L 三氟乙酸3 mL 封管, 121 ℃水解4 h,旋转蒸干,加甲醇4 mL溶解后蒸干, 重复加甲醇3~5次除净三氟乙酸,加水2 mL溶解后过滤,滤液旋转干燥即得水解产物[ 17 ] 。单糖测定所用色谱条件如下:色谱柱为CAPCELL PAK NH2 柱UG80,柱温40 ℃,流动相为乙腈:水= 80: 20,流速1. 0 mL /min,检测器为R I。氨基酸测定需先将水解产物经DABS衍生。所用色谱条件如下:色谱柱为Diamonsil TM C18,检测器为UV,检测波长为436nm[ 18 ] 。
2. 6 IR及NMR分析多糖结构
采用KBr压片法进行红外光谱分析[ 4 ] 。以D2O 22食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期
为溶剂, TSP为内标,进行核磁共振氢谱(1H2NMR)及碳谱(13 C2NMR)分析[ 19222 ] 。
2. 7 化学法辅助分析多糖结构
精密称取纯化多糖25 mg进行高碘酸氧化。取部分氧化后溶液测定甲酸生成量,与高碘酸消耗量比较。
其他部分用于Smith降解;高碘酸氧化产物加乙二醇还原剩余高碘酸,经截流相对分子质量5 000的超滤膜常压超滤得到多糖醛, 40 ℃以下浓缩加70 mg硼氢化钾还原,醋酸调pH5. 5,超滤,冻干得多糖醇。多糖醇加2 mol/L H2 SO4 2 mL封管, 100 ℃水解8 h,碳酸钡中和,过滤,滤液浓缩, HPLC检测降解产物。色谱条件同2. 5单糖测定,对照品为赤藓醇、甘油和葡萄糖[ 23 ] 。2011-1-2
3 结果
3. 1 离子交换层析和凝胶层析
见图1。5~30管被PBS洗出未与离子交换剂结合部分,收集合并得到多糖PL2A粗品; 65~85管为梯度洗脱部分,合并得到蛋白聚糖PL2B 粗品。分别将冻干后的2种粗品经凝胶层析收集集中部分,得到精制PL2A, PL2B (图2) 。
图1 桑黄粗多糖在DEAE2纤维素层析柱上的洗脱曲线
3. 2 相对分子质量测定
6种标准相对分子质量多糖经高效液相凝胶色谱柱,记录保留时间,对应其Mr 与分配系数Kav ,得到校正标准曲线Kav = - 0. 3629 lg M r + 1. 9290, r = 0. 994 2; Kav = (Ve - V0 ) / (Vt - V0 ) , Ve , V0 , Vt 分别相当于待测多糖、相对分子质量2 000 000对照品、相对分子质量180对照品的保留时间。得到PL2A, PL2B 的M r分别为14. 2 ×103 , 22. 2 ×103。
图2 PL2A和PL2B粗品分别在Sephadex G250层析柱上的洗脱曲线
3. 3 糖含量及蛋白质含量
多糖PL2A中总糖含量为98 % ,还原糖占7 %;蛋白聚糖PL2B中总糖含量为71 % ,还原糖占12 %,蛋白质含量为7 %。
3. 4 单糖及氨基酸组成
PL2A的单糖组成主要为葡萄糖,还有少量甘露糖; PL2B中构成多糖主要成分为葡萄糖,还有少量甘露糖和鼠李糖,构成蛋白质的主要氨基酸为缬氨酸、赖氨酸及少量天冬氨酸、甘氨酸。
3. 5 红外光谱法与核磁共振分析多糖结构
IR:见图3和图4。PL2A, PL2B均在3 400 cm21左
右出现O2H的伸缩震动引起的一处宽峰; 2 895 cm21 , 1 418 cm
21为C2H 吸收峰,此为糖类的特征峰。1 073 cm
21为吡喃糖环醚键或羟基峰; 897 cm
21为吡喃糖β端基特征峰,呋喃糖无此吸收峰; 810 cm
21左右弱吸收峰
表明有少量甘露糖的存在。另外PL2B 还出现1 612 cm21与1 414 cm
21处羧基特征峰[ 24 ] 。红外光谱结果证
明PL2A, PL2B均含β2吡喃糖, PL2B 中含有酸性糖或氨基酸。
食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期 2011-1-3
23 PL2A的红外光谱图
图4 PL2B的红外光谱图 1H2NMR:见图5和图6。C1 质子化学位移均小于5 ppm,证明PL2A, PL2B均只含β型吡喃己糖,与红外结果相符; PL2A, PL2B均检测出甲基峰,推测由甲基五碳糖或含甲基的氨基酸产生。
图5 PL2A的1H2NMR图
图6 PL2B的1H2NMR图
13 C2NMR:见图7和图8。PL2A, PL2B均显示多重峰,表示多糖结构的复杂性。通过比较化学位移已归属的取代单糖或简单寡糖来归属未知多糖,将PL2A, PL2B图谱信号归属如下[ 25, 26 ] ,内标为四氘代三甲硅烷丙酸钠( TSP) 。
图7 PL2A的13C2NMR图
图8 PL2B的13C2NMR图
PL2A:δ105. 92105. 4 为β2D 2葡萄糖的异头碳信号,δ87. 8为取代后的C3 信号峰,δ71. 7为取代后的C6 信号峰,δ75. 9,δ77. 8,δ71. 3,δ78. 4,δ63. 6分别为未取代的C2 , C3 , C4 , C5 , C6 信号峰;δ100. 8 弱峰推测为所含少量甘露糖的异头碳信号。PL2B:δ105. 22105. 7为β2D2葡萄糖的异头碳信号, δ87. 3为取代后的C3 信号峰,δ71. 6为取代后的C6 信
号峰,δ76. 0,δ77. 7,δ71. 1,δ78. 4,分别为未取代的C2 ,
24 食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期
C3 , C4 , C5 信号峰。δ179. 0表示有羧基或乙酰氨基存在,δ21. 2,δ15. 9,δ36. 3为甲基碳或亚甲基碳信号峰,推测由甲基五碳糖或含甲基的氨基酸产生。δ62~δ65存在3组峰,证明另有3种未取代的C6 ,推测可能为不同连接方式的β2D2葡萄糖与β2D2甘露糖的C6。
3. 6 高碘酸氧化及Smith降解产物分析[ 23 ] 多糖PL2A, PL2B经氧化反应完全后,测得平均每1 mol己糖分别消耗高碘酸0. 38 mol, 0. 51 mol,释放甲酸的量分别为0. 17 mol, 0. 23 mol,降解产物HPLC 均检测出大量葡萄糖及少量甘油,无赤藓醇,表明多糖PL2A含还原端和1 →3, 1 →6, 1 →3, 6 糖苷键, 其中1→3键构成主链结构。PL2B 含还原端和1 →3, 1→6, 1→3, 6糖苷键,还可能存在1→2糖苷键,其中1→3键构成主链结构。
4 结论
桑黄子实体提取粗多糖经过分离纯化,分别得到Mr 为14. 2 ×103 和22. 2 ×103 的多糖PL2A和蛋白聚糖PL2B; PL2A, PL2B 均含多量葡萄糖及少量甘露糖; 多糖PL2A, PL2B主链均是β2( 1 →3) 2结构的葡聚糖。
PL2A主链上可能存在以1 →6 连接的甘露糖残基分支。PL2B主链上可能存在以1 →6, 1→2方式连接的葡萄糖、甘露糖、鼠李糖及氨基酸残基分支。
参考文献
[ 1 ] 刘波. 中国药用真菌[M ]. 太原:山西人民出版社, 1974: 71273.
[ 2 ] 卯晓岚. 中国大型真菌[M ]. 郑州:河南科学技术出版社, 1999:
4772479.
[ 3 ] 戴玉成. 药用担子菌2鲍氏层孔菌(桑黄)的新认识[ J ]. 中草药,
2003, 34 (1) : 94. 2011-1-4
(1. 山东省药学科学院,山东济南 250101;
2. 军事医学科学院微生物流行病研究所,北京 100071)
摘 要: 目的 从桑黄子实体中分离具有抗肿瘤活性的多糖成分,并进行结构分析。方法 热水浸提法提取桑黄子实体中的粗多糖,经醇沉、冷冻干燥、离子交换层析、凝胶层析和超滤,得到纯度较高的多糖,通过HPLC、IR、1H2NMR、13 C2NMR、高碘酸氧化及Smith降解确定2种多糖的相对分子质量、组成及结构。结果 分离纯化得到相对分子质量分别为14. 2 ×103 , 22. 2 ×103 的多糖PL2A及蛋白聚糖PL2B,两者都是结构复杂的中性杂多糖。PL2B中,糖占71% ,蛋白质占7%; PL2A, PL2B均含大量葡萄糖及少量甘露糖, PL2B中还有部分鼠李糖; PL2B所含氨基酸包括缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸。结论 多糖PL2A与蛋白聚糖PL2B为首次从桑黄子实体中提取到的多糖成分。
关键词: 桑黄; 多糖; 纯化; 结构
中图分类号: R284. 2 文献标识码: A 文章编号: 16722979X (2009) 0720021205
桑黄( Phellinus linteus ) 属担子菌亚门(B asidiom ycotina) ,层菌纲(Hym enom y cetes) ,多孔菌目(Aphyllophorales) ,多孔菌科( Polyporaceae) , 针层孔菌属( Phellinus) , 主要寄生在桑树树干上[ 1 ] 。现泛指同属的一些种类,东亚地区将其拉丁名称为Phellinus lin2 teus (Berk &M. A. Curtis) Teng,也有些学者将产自中国的桑黄归为火木层孔菌或针层孔菌( Phellinus ignia2 rius) [ 2 ] ,或鲍氏层孔菌( Phellinus baum ii Pilat) [ 3 ] 。食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期 21
目前不少研究表明,桑黄子实体的水提取物能明显抑制肿瘤生长,尤其对小鼠肉瘤S180 有较强的的抑制作用[ 4 ] 。后来研究证明桑黄中的抗肿瘤活性成分主要为多糖类物质[ 5 ] 。对其活性机制的研究表明,桑黄多糖可以明显延长植入黑素瘤B16F10小鼠的寿命,减少黑素瘤B16F10的肺转移率[ 6 ] 。桑黄多糖能通过增强巨噬细胞、自然杀伤细胞及B细胞的活性来抑制肿瘤的生长和转移,既是免疫增强剂,又可作为肿瘤细胞附着的直接抑制剂[ 7211 ] 。12-31
1 材料
1. 1 主要仪器
UV21601 PC紫外可见分光光度计(日本岛津) ;十万分之一BP211D电子天平( Sartorious) ; YB22真空恒温干燥箱(天津药典标准仪器厂) ; FD21 冷冻干燥机(北京博医康技术公司) ; LABORATA 4000 旋转蒸发仪( Heidolph ) ; ASV23023 电子高压消毒锅(日本SAKURA) ;Vivaflow200超滤包(德国V IVASCIENCE) ; 蠕动泵(美国M ILL IPORE) ;Waters2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器、410示差检测器(Waters) ; CAP2 CELL PAK NH2 UG80色谱柱(日本资生堂) ; TSK gel G3000 PW XL色谱柱(日本TOSOH) ; Diamonsil TM C18 色谱柱(迪马公司) ; FTS265A 红外光谱仪(美国B io2 Rad) ; UN ITY INOVA 600 超导核磁共振谱仪(美国Varian)
1. 2 试剂
乙二氨基乙基纤维素(DEAE2Cellulose, Sigma) ;葡聚糖凝胶( Sephadex, G250, Pharmacia) ;右旋糖苷分子质量标准对照品(中国药品生物制品检定所) ;三氟乙酸(ACROS) ; 对二甲氨基偶氮苯磺酰氯(DABS Cl, Fluka) , Folin2酚乙试剂,牛血清蛋白( Sigma) ,其他试剂均为国产分析纯。
1. 3 原料
桑黄子实体原料来自东南亚,批号20041201。
2 方法
2. 1 粗多糖的提取
桑黄子实体原料,粉碎后取粉末200 g于3 L沸水回流8 h,重复3次,将滤液合并后浓缩,冷冻干燥,所得产物即水提粗多糖。加少量水溶解,加5倍体积的,95 %乙醇于4 ℃放置24 h,离心收集沉淀,即得醇沉粗多糖[ 6 ] 。
2. 2 离子交换层析和凝胶层析
DEAE2纤维素柱( 4 cm ×60 cm) 经5 mmol PBS (pH 7. 7)平衡12 h,醇沉粗多糖溶于少量缓冲液后上样。先用同种缓冲液(500 mL)以5 mL /min流速洗涤未与阴离子交换剂结合部分,后用0. 1 ~1. 0 mol/L NaCl溶于缓冲液制成的梯度洗脱液(共1 000 mL)洗脱与交换剂结合部分,最后以1. 0 mol/L NaCl2缓冲液(500 mL)洗脱,每10 mL 收集产物,硫酸苯酚法呈阳性部分分别合并,超滤除盐,冻干[ 11 ] 。
Sephadex G250凝胶柱层析(1. 6 cm ×40 cm)进一步纯化产品,凝胶柱经20 mmol NaCl溶液平衡后,分别将适量冻干产品溶于该流动相后上样,按0. 2 mL / min洗脱,硫酸苯酚法呈阳性部分合并,超滤除盐,冻干[ 12 ] 。
2. 3 高效液相凝胶色谱法测定多糖相对分子质量选用相对分子质量(Mr ) 180, 4 600, 7 100, 10 000, 21 400, 2 000 000的右旋糖苷作为对照品。色谱条件如下:色谱柱TSK gel, G3000 PW XL,柱温40 ℃,流动相为20 mmol/L HAc2NaAc缓冲液(pH 5. 7) ,流速0. 4 mL /min,检测器为R I[ 13 ] 。2011-1-1
2. 4 糖含量及蛋白质含量确定
硫酸苯酚法测定样品中总糖含量[ 14 ] ,二硝基水杨酸(DNS)法测定其中还原糖含量[ 15 ] , Lowry法测定结合多糖中的蛋白质含量[ 16 ] 。
2. 5 HPLC法确定单糖及氨基酸组成
多糖充分水解后, HPLC测定其单糖及氨基酸组成。纯化多糖3 mg加2 mol/L 三氟乙酸3 mL 封管, 121 ℃水解4 h,旋转蒸干,加甲醇4 mL溶解后蒸干, 重复加甲醇3~5次除净三氟乙酸,加水2 mL溶解后过滤,滤液旋转干燥即得水解产物[ 17 ] 。单糖测定所用色谱条件如下:色谱柱为CAPCELL PAK NH2 柱UG80,柱温40 ℃,流动相为乙腈:水= 80: 20,流速1. 0 mL /min,检测器为R I。氨基酸测定需先将水解产物经DABS衍生。所用色谱条件如下:色谱柱为Diamonsil TM C18,检测器为UV,检测波长为436nm[ 18 ] 。
2. 6 IR及NMR分析多糖结构
采用KBr压片法进行红外光谱分析[ 4 ] 。以D2O 22食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期
为溶剂, TSP为内标,进行核磁共振氢谱(1H2NMR)及碳谱(13 C2NMR)分析[ 19222 ] 。
2. 7 化学法辅助分析多糖结构
精密称取纯化多糖25 mg进行高碘酸氧化。取部分氧化后溶液测定甲酸生成量,与高碘酸消耗量比较。
其他部分用于Smith降解;高碘酸氧化产物加乙二醇还原剩余高碘酸,经截流相对分子质量5 000的超滤膜常压超滤得到多糖醛, 40 ℃以下浓缩加70 mg硼氢化钾还原,醋酸调pH5. 5,超滤,冻干得多糖醇。多糖醇加2 mol/L H2 SO4 2 mL封管, 100 ℃水解8 h,碳酸钡中和,过滤,滤液浓缩, HPLC检测降解产物。色谱条件同2. 5单糖测定,对照品为赤藓醇、甘油和葡萄糖[ 23 ] 。2011-1-2
3 结果
3. 1 离子交换层析和凝胶层析
见图1。5~30管被PBS洗出未与离子交换剂结合部分,收集合并得到多糖PL2A粗品; 65~85管为梯度洗脱部分,合并得到蛋白聚糖PL2B 粗品。分别将冻干后的2种粗品经凝胶层析收集集中部分,得到精制PL2A, PL2B (图2) 。
图1 桑黄粗多糖在DEAE2纤维素层析柱上的洗脱曲线
3. 2 相对分子质量测定
6种标准相对分子质量多糖经高效液相凝胶色谱柱,记录保留时间,对应其Mr 与分配系数Kav ,得到校正标准曲线Kav = - 0. 3629 lg M r + 1. 9290, r = 0. 994 2; Kav = (Ve - V0 ) / (Vt - V0 ) , Ve , V0 , Vt 分别相当于待测多糖、相对分子质量2 000 000对照品、相对分子质量180对照品的保留时间。得到PL2A, PL2B 的M r分别为14. 2 ×103 , 22. 2 ×103。
图2 PL2A和PL2B粗品分别在Sephadex G250层析柱上的洗脱曲线
3. 3 糖含量及蛋白质含量
多糖PL2A中总糖含量为98 % ,还原糖占7 %;蛋白聚糖PL2B中总糖含量为71 % ,还原糖占12 %,蛋白质含量为7 %。
3. 4 单糖及氨基酸组成
PL2A的单糖组成主要为葡萄糖,还有少量甘露糖; PL2B中构成多糖主要成分为葡萄糖,还有少量甘露糖和鼠李糖,构成蛋白质的主要氨基酸为缬氨酸、赖氨酸及少量天冬氨酸、甘氨酸。
3. 5 红外光谱法与核磁共振分析多糖结构
IR:见图3和图4。PL2A, PL2B均在3 400 cm21左
右出现O2H的伸缩震动引起的一处宽峰; 2 895 cm21 , 1 418 cm
21为C2H 吸收峰,此为糖类的特征峰。1 073 cm
21为吡喃糖环醚键或羟基峰; 897 cm
21为吡喃糖β端基特征峰,呋喃糖无此吸收峰; 810 cm
21左右弱吸收峰
表明有少量甘露糖的存在。另外PL2B 还出现1 612 cm21与1 414 cm
21处羧基特征峰[ 24 ] 。红外光谱结果证
明PL2A, PL2B均含β2吡喃糖, PL2B 中含有酸性糖或氨基酸。
食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期 2011-1-3
23 PL2A的红外光谱图
图4 PL2B的红外光谱图 1H2NMR:见图5和图6。C1 质子化学位移均小于5 ppm,证明PL2A, PL2B均只含β型吡喃己糖,与红外结果相符; PL2A, PL2B均检测出甲基峰,推测由甲基五碳糖或含甲基的氨基酸产生。
图5 PL2A的1H2NMR图
图6 PL2B的1H2NMR图
13 C2NMR:见图7和图8。PL2A, PL2B均显示多重峰,表示多糖结构的复杂性。通过比较化学位移已归属的取代单糖或简单寡糖来归属未知多糖,将PL2A, PL2B图谱信号归属如下[ 25, 26 ] ,内标为四氘代三甲硅烷丙酸钠( TSP) 。
图7 PL2A的13C2NMR图
图8 PL2B的13C2NMR图
PL2A:δ105. 92105. 4 为β2D 2葡萄糖的异头碳信号,δ87. 8为取代后的C3 信号峰,δ71. 7为取代后的C6 信号峰,δ75. 9,δ77. 8,δ71. 3,δ78. 4,δ63. 6分别为未取代的C2 , C3 , C4 , C5 , C6 信号峰;δ100. 8 弱峰推测为所含少量甘露糖的异头碳信号。PL2B:δ105. 22105. 7为β2D2葡萄糖的异头碳信号, δ87. 3为取代后的C3 信号峰,δ71. 6为取代后的C6 信
号峰,δ76. 0,δ77. 7,δ71. 1,δ78. 4,分别为未取代的C2 ,
24 食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第07期
C3 , C4 , C5 信号峰。δ179. 0表示有羧基或乙酰氨基存在,δ21. 2,δ15. 9,δ36. 3为甲基碳或亚甲基碳信号峰,推测由甲基五碳糖或含甲基的氨基酸产生。δ62~δ65存在3组峰,证明另有3种未取代的C6 ,推测可能为不同连接方式的β2D2葡萄糖与β2D2甘露糖的C6。
3. 6 高碘酸氧化及Smith降解产物分析[ 23 ] 多糖PL2A, PL2B经氧化反应完全后,测得平均每1 mol己糖分别消耗高碘酸0. 38 mol, 0. 51 mol,释放甲酸的量分别为0. 17 mol, 0. 23 mol,降解产物HPLC 均检测出大量葡萄糖及少量甘油,无赤藓醇,表明多糖PL2A含还原端和1 →3, 1 →6, 1 →3, 6 糖苷键, 其中1→3键构成主链结构。PL2B 含还原端和1 →3, 1→6, 1→3, 6糖苷键,还可能存在1→2糖苷键,其中1→3键构成主链结构。
4 结论
桑黄子实体提取粗多糖经过分离纯化,分别得到Mr 为14. 2 ×103 和22. 2 ×103 的多糖PL2A和蛋白聚糖PL2B; PL2A, PL2B 均含多量葡萄糖及少量甘露糖; 多糖PL2A, PL2B主链均是β2( 1 →3) 2结构的葡聚糖。
PL2A主链上可能存在以1 →6 连接的甘露糖残基分支。PL2B主链上可能存在以1 →6, 1→2方式连接的葡萄糖、甘露糖、鼠李糖及氨基酸残基分支。
参考文献
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