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珍稀药用真菌~~桑黄 第六章
第六章桑黄的液体发酵技术
第一节 液体深层发酵技术
液体深层发酵技术属于现代生物技术之一,这一概念是20世纪40年代由美国弗吉尼亚大学当时的生物工程专家ElmerL.Gaden Jr提出的,他设计出培养微生物系统的生物反应器,成为该技术的权威。在19世纪末和20世纪初,巴斯德学派的后继人跨出了医学领域,试图将微生物用于工业生产,这一尝试取得了更为直接有效的结果,并建立了食品酵母深层通风发酵工业。时至今日,在医药、食品发酵工业方面已有比较先进的生物反应器及配套设施,在理论和实践上都已经大大地向前推进了。l948年美国的H.Humfeld首次应用该技术培养出了蘑菇菌丝体。l958年J.Szuecs第一个用发酵缸来培养羊肚菌。国内较早报道的是上海植物生理研究所于1960年进行的香菇等的深层发酵。l973年林忠平等进行了灵芝的深层发酵研究。80年代后,国内外纷纷开展了这一技术的研究与应用探讨。
采用液体发酵培养所获得的菌丝体,其各种活性成分均类似于子实体。而且,在液体深层培养过程中,菌丝绸胞能在反应器中(发酵罐或大三角瓶)处于最适温度、最适酸碱度,最适碳、氮比等条件下生长,呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放,因此新陈代谢旺盛,菌丝生长迅速,在短时问内就可以获得大量菌丝体,而且,具有生产时间短,效率高,成本低等优点。同时,还会在发酵液中产生多糖、生物碱、萜类化合物、甾醇、甙类、酚类、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物等多种生理活性物质。这些物质分别对心血管、肝脏、神经系统、肾脏、性器官等人体器官疾病具有预防治疗作用。并具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效。目前食用菌液体发酵已获得巨大进展,与固体发酵和人工栽培相比,食药用菌液体发酵有以下几个优势与局限性。
1.原料来源广泛
食药用真菌的液体发酵可用工业淀粉、山芋粉、豆粕、鼓皮等廉价工农业产品为原料。还可利用工业废水,如木材水解液、各种大豆深加工废水、玉米深加工废水及淀粉废水等作为原料。
2.生长快速
由于生化反应器内装有通气搅拌系统、温度调节系统、pH值调节系统和培养基补给系统等装置,能控制最佳的培养条件。在短时间内积累大量菌丝体和具有生理活性的次生代谢产物。
3.生产周期短
食药用真菌液体发酵一般仅需要3~10天就可以获!得大量的菌丝体和生理活性物质,而固体培养基则需30—60天.人工栽培子实体时间更长。
4.工业化生产
食药用真菌液体发酵是在生化反应器内、通过控制最佳条件来培养菌丝体,不受季节限制,生产工艺规范;固体栽培生产往往需要较大的空间,条件难以控制,受季节性影响较大。液体培养,就能克服上述缺点。
二、食药用真菌液体发酵的局限性
1.设备昂贵
食药用真菌的液体发酵需要成套的设备,且价格昂贵,不利于在广大农村推广。
2.污染:不易控制食药用:真菌的液体发酵是一个完整的系统,中间任何一个环节都要严格控制,一旦种子带菌、接种操作不当、培;养基或 发酵{罐灭菌不彻底都会造成倒罐,带来巨大的经济损失。
三、食药用真菌液体发酵前景
食药用真菌液体深层发酵技术发展的非常迅速。到目前为止,利用液体深层发酵技术生产食药用真菌菌丝体,提取其有效成分来进行制药有了很大的发展。例如,猴头菌、蜜环菌、亮菌、云芝、树舌、安络小皮伞、麦角菌、冬虫夏草等食药用真菌已有较完整的发酵生产工艺,制剂已大量投入市场。利用深层培养的云芝菌丝制剂,可有效治疗慢性气管炎及乙型肝炎;从猴头菌菌丝体培养物中制成浸膏片、猴菇菌片,对于胃癌、直肠癌、食道癌有一定疗效。
另外,蜜环菌片、银耳孢子糖浆等液体发酵的药品,应用于临床,有很好疗效。此外,中国医学科学院药物研究所研制的“金水宝”胶囊,南京中医学院研制的“槐耳冲剂”,应用于临床和保健,都取得较好的效果。还有,利用液体发酵技术通过食药用菌菌丝体对微量元素如锗、硒、锌、碘等进行富集,已为开发功能性食品提供了一条可行的途径。从长远看,食药用菌液体发酵将在以下方面有所作为:
1.许多食药用菌在液体发酵培养过程中会产生多种生理活性物质,虽然这些物质从子实体中也可获得,但无论从生产规模、生产周期及经济效益等方面均不及用液体培养来获取为好。有些特殊成分的含量还远高于子实体。因此,开发利用液体发酵的食药用菌菌丝体及其发酵液来制备药物将具有一定的发展前景。
2.液体发酵菌丝体的营养成分,无论是蛋白质、氨基酸还是维生素均类似于子实体。因此,用液体发酵菌丝体可以制备食用菌饮料、调味品、食品添加剂及饲料添加剂等。
3.用液体发酵法生产菌丝体要比栽培生产子实体简便、快速,并且,许多目前还不能进行人工栽培的野生食药用菌(姬松茸等)可以采用液体发酵技术来生产菌丝体和获取代谢产物,从而使这些野生食药用菌的研究和开发利用切实可行。
4.利用药用真菌发酵来加工中药,药用真菌的次生代谢产物可以和中药的有效成分发生复方、协同作用,达到提高药效的作用或产生新的保健、预防或治疗功能。利用药用真菌进行中药的纯种液体发酵加工的研究正在探索阶段。
食药用真菌液体发酵已作为药用真菌生产发展的一个新方向,具有很强的生命力。同时,食药用真菌深层发酵作为一个新兴的产业有着巨大的发展潜力,但也必须加强对生化反应器中食用菌生理生化特点的研究,发展新的牛产工艺,根据发酵菌种的特点应用中间补料和进一步过渡到连续发酵的方式,提高产物的得率和生产率,开发新的高附加值产品,才能提高质量,降低成本,使更多的食用菌液体发酵产品走向商品市场。
第二节 桑黄的液体发酵技术
随着近几年人们对桑黄药理学和化学成分分析的研究,桑黄被公认为是抗癌作用最好的真菌。因而,桑黄的应用会越来越广泛,需求量也会越来越大,天然的桑能满足需求的。而人工栽培桑黄子实体目前又难以成为
稳定的工业产品来源。相对比之下,桑黄液体深层发酵就
成为一条为桑黄产业化提供保证的有效途径。
一、桑黄液体深层发酵生产的主要条件
1.无菌室 ,
无菌室是转接菌种的场所,要求严格地控制杂菌污染,既要有玻璃门窗通风,又要能够控制空气进入。接种室面积不宜过大,9平方米为宜。接种室内要求地面、墙壁、屋顶必须清洁,室内装有紫外灯。接种室必要时还应有一个缓冲间,以减少空气直接进入接种室。
2.高压灭菌设备
可以根据培养量的大小自行选择不同规格的高压灭菌锅。
3.恒温培养箱、可控温调速旋转式摇床(图8)、自控式发酵罐设备(图9、图l0)等。
4.其他设备即材料
,超净工作台、玻璃瓶若干、酒精灯、镊子、小口瓶、三角瓶、各种形状接种针、解剖刀、小剪刀、小称、温湿度计、天平、试管、量杯、脱脂棉、纱布、酒精、高锰酸钾、升汞等。
5桑黄菌种
桑黄菌种可以直接购买,也可通过子实体分离得到。
二、斜面培养基母种生产过程
(一)斜面培养基的配制及其灭菌
培养基组成按(克/l000毫升)比例配制,马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,磷酸二氢钾3克,硫酸镁1.5克,琼脂20克,pH自然,维生素8。10毫克,加水定容至所需体积。
先将马铃薯洗净去皮,称取200克,切成小薄片,放人瓷缸中,加水l000毫升,加热煮沸,待马铃薯片软熟后,将澄清液倒入另一烧杯,弃掉马铃薯片,然后,将称好的琼脂,加入马铃薯澄清液中,加热熔化,待琼脂全部熔化后,再放人其他几种称量好的物质,不断搅拌,全部溶解后补充所蒸发的水分,稍加搅拌使之均匀,趁热分装试管,装量为试管长度的五分之一左右,装完后塞好棉塞,然后,扎成捆,上端用报纸(内层)和硫酸纸(外层)包好。竖立放入高压灭菌锅内在1~1.2千克/平方厘米,的压力下,灭菌30分钟,然后取出试管,待温度降至50。C~60。(2时,摆成斜面冷凝备用。
在一般情况下,第一次使用高压灭菌锅时,应将冷却后的斜面试管抽取l/4,置放在27℃~30。C的恒温箱中,保温培养3天后检查,若未发现斜面长出任何细菌或真菌,则证明灭菌彻底,以后则不必每次抽取保温培养检查。
高压灭菌锅在压力l.1千克时,锅内温度可达l21℃,在这样高的温度下保持20~30分钟,完全可以杀灭培养基或其他液体所带的细菌、真菌。有人不了解这一情况,随意加大灭菌锅压力和延长保压灭菌时间,会使培养基中营养成分遭到破坏,酸度增高,直至不能凝固。
灭菌好的斜面试管要尽快使用,一时用不完的可放在0℃~5℃的冰箱中保存一定时间,也可放在室温下保持一段时间。一般将试管放在20%以上或30。C以下的恒温条件下培养5~7天,观察试管内培养基表面是否有异常现象出现,若有黄、绿、黑、青或黏液出现即是杂菌,证明灭菌未彻底,就不能使用,若没有其他异常现象就可使用。
(二)桑黄菌种的分离
1.子实体的消毒
先将新鲜的桑黄子实体表面用清水冲洗干净去掉泥沙和污物,用纱布擦于水分,后移到无菌室内,用0.1%的升汞液中浸泡3分钟,再用无菌水冲洗数次进行表面消毒。
2.组织分离
将消毒好的桑黄子实体用解剖刀从子实体中部纵切一刀,将中间部分切取一小块组织,迅速移接到斜面培养基上,加上棉塞,置恒温培养箱内,26℃培养,6天后可见组织块上长出绒毛状菌丝。经过7~10天的培养观察,菌丝已基本长满培养基表面,从中可选择菌丝生长快、生长健壮、旺盛的菌丝试管作为转管提纯使用。
3.转管提纯
经过分离出来的桑黄菌丝,都必须要经过2~3次的转管提纯,进一步观察菌丝生长变化情况以及菌丝的纯度情况和稳定性。选取优良旺盛的菌丝,去掉老化、退化、变化的菌丝。
灵芝菌丝生长情况有各种各样,若在琼脂培养基上表现生长缓慢、纤细、稀薄、弱乱,或者不长,甚至出现一凸一凹等症状。这类菌丝都不能使用,否则就会影响菌种质
量,降低产量。所以为了提高菌种质量,必须从试管母种选育开始,选择菌丝生长旺盛、健壮的作为接种的母种使用。
三、摇瓶种子培养
(一)摇瓶培养基的配制及其灭菌
培养基组成按(克/l000毫升)比例配制,葡萄糖2~4克,蛋白胨0.05~0.5克,麸皮汁1.0~2.5克,磷酸二氢钾0.1~0.5克,硫酸镁0.01~0.2克,按配方称取各种药品,加水定容至所需体积,pH值为4.5~5.0。微微加热,搅拌使药品溶解,然后,将培养液分装于250毫升三角瓶中,每瓶装50毫升,加上棉塞,外面包一层硫酸纸,竖立放入高压灭菌锅内,在1~1.2千克/平方厘米的压力下,121 0C,灭菌30分钟,冷却后取出备用。
(二)菌种转接
将斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶中,接种前预先将超净工作台打扫干净,用75%的酒精或高锰酸钾溶液擦洗遍,再把装有摇瓶培养基的三角瓶及其他用具都放人超净工作台。消毒方法可采用两种方法同时进行。紫外灯照射、高锰酸钾和甲醛混合进行气化消毒30分钟接种。采取紫外灯一般照射30分钟。接种时,双手先用75%的酒精消毒后,再伸人超净工作台,点燃酒精灯,把接种针放在火焰上烧红晾凉后使用。斜面菌种试管的棉塞表皮和装有摇瓶培养基的三角瓶的棉塞可在酒精火焰上烧一下,在酒精灯上方拔掉斜面菌种试管棉塞,用接种钩把试管内的母种培养基挑取蚕豆大的一块,同时打开三角瓶棉塞,快速放人装有摇瓶培养基的三角瓶内,接种后立刻塞上棉塞,再进行第二瓶操作。
(三)培养条件
将接入斜面母种的三角瓶放入可调速旋转式摇床,设定培养温度26。C,转速120转/分,培养5天,即得液体摇瓶种子。然后转接人二级摇瓶进行扩大培养。
四、二级摇瓶种子扩大培养
(一)摇瓶培养基的配制及其灭菌
培养基组成按(克/l000毫升)比例配制,葡萄糖2~4克,蛋白胨0.05~0.5克,麸皮汁1.0~2.5克,磷酸二氢钾0.1~0.5克,硫酸镁0.01~0.2克,按配方称取各种药品,加水定容至所需体积,pH值为4.5—5.0。微微加热,搅拌使药品溶解,然后,将培养液分装于500毫升三角瓶中,每瓶装140毫升,加上棉塞,外面包一层硫酸纸,竖立放入高压灭菌锅内,在1~1.2千克/平方厘米的压力下,121℃,灭菌30分钟,冷却后取出备用。
(二)菌种转接
将摇瓶菌种转接人装有摇瓶扩大培养基的摇瓶再进行扩大培养,接种前预先将超净工作台打扫干净,用75%的酒精或高锰酸钾溶液擦洗遍,再把装有摇瓶培养基的三角瓶及其他用具都放人超净工作台。消毒方法可采用两种方法同时进行。紫外灯照射、高锰酸钾和甲醛混合进行气化消毒30分钟接种。采取紫外灯一般照射30分钟。接种时,双手先用75%的酒精消毒后,再伸人超净工作台,点燃酒精灯,把接种针放在火焰上烧红晾凉后使用。将装有摇瓶菌种的三角瓶和装有摇瓶培养基的三角瓶的棉塞在酒精火焰上烧一下,在酒精灯上方拔掉棉塞,快速将摇瓶菌种倒入装有摇瓶培养基的三角瓶内,接种后立刻塞上棉塞,再进行第二瓶操作。
(三)培养条件
将种龄5天的液体摇瓶种子按20%接种量接入装有摇瓶培养基的500毫升三角瓶中,放入可调速旋转式摇床,设定培养温度26。C,转速120转/分,培养3天,即得二级摇瓶扩大种子。然后转接入一个装有种子培养基的一级种子发酵罐中,进行培养。
五、一级种子培养
(一)种子培养基的配制
培养基组成按(克/l000毫升)比例配制,葡萄糖2~4克,蛋白胨0.03~0.7克,玉米浆0.5~1.5克,玉米粉0.5~2克,麸皮汁1~3克,磷酸二氢钾0.1~0.5,磷酸二氢钾0.01~0.2克,按配方称取各种药品,加水定容至所需体积,pH值为4.5~5.0。微微加热,搅拌使药品溶解,然后,将培养液倒人已进行空气过滤器消毒和空罐消毒的种子发酵罐中,进行实消。
(二)种子发酵罐的消毒
1.空气过滤器消毒
缓慢打开蒸汽,先排出蒸汽管路凝结水,逐渐打开蒸汽阀门,使蒸汽过滤器压力表指示在0.13~0.14兆帕之间,然后慢慢打开阀门,使蒸汽通过空气过滤器,观察客气过滤器压力表显示,控制在0.11~0.12兆帕之间。过滤器消毒30~50分钟。消毒时,流经空气过滤器的蒸汽压力不得超过0.12兆帕,蒸汽流量也不能太大,否则会损坏空气过滤器滤芯,使其失去过滤功能。然后,打开空气阀门,控制空气流量在1:0.3v/v•m左右,吹干空气过滤器。
2.空消
固定好罐盖螺栓,将接种口、补料口、电极插孔堵塞等紧固。注意,罐盖密封螺栓应对称拧,牢靠即可,不要拧得过紧,防止损坏螺栓和橡胶密封圈。然后排尽夹套内存
水,打开罐顶放气阀,排出管路凝结水,向罐体通人蒸汽。使罐压稳定在0.ii~0.12兆帕之间,不得超过0.15兆怕,空消30~50分钟。然后关闭蒸汽,打开空气阀门,向罐体通入空气,以保证罐内正压。使罐压维持在0.03~0.05兆帕之间。
3.实消
关闭空气阀门,打开罐顶放气阀,卸去罐内压力。安装好PH、D0电极,倒人配好的种子培养基,补水。培养基灭菌过程中,蒸汽将会带人一定量的凝结水,使灭菌后培
养基体积升高,同时考虑接种时种子带人的液体体积,故培养基配制时须相应的减少水的加入量。具体加水量要明确实消过程增加的凝结水量后再调整。然后开始升温,排空夹套内残水,对发酵培养液进行预热。此时可低速搅拌培养液,当温度达到80%时,停止搅拌。向罐内通人蒸汽加速升温,并对空气进罐管路灭菌。罐温到达灭菌温度后,使罐压保持在0.11~0.12兆帕之间,实消30~40分钟。实消时间不足将无法灭菌彻底,太长会过多地破坏培养基营养成分。计时结束后,关闭蒸汽,打开空气阀门。开始自然降温减压。保证罐压在0.03~0.05兆帕之间。不得过低,否则极易吸入外界空气造成染菌。
(三)接种
当培养液温度降到接种温度时就可以进行接种了,将二级摇瓶种子接人种子发酵罐中。将无污染的摇瓶种子在超净工作台上尽量合并后备用。并准备打火机、75%酒精棉、95%酒精、棉花、钳子、接种口扳手。用酒精棉消毒接种者的双手,并擦洗罐顶接种口,在接种Ll周围围上棉花,倒上95%酒精。调节进气阀门,减少进气量,罐压降至0.01兆帕以下,点燃酒精棉,用专用扳手拧下接种口螺母,并将其放入预先准备好的75%酒精容器中。在火焰上拔下种子瓶塞,用火焰灼烧瓶口,迅速将菌种倒人种子发酵罐内。盖上接种口螺母,拧紧,熄灭火焰。
(四)培养条件
将二级摇瓶种子按l0%接种量接人种子发酵罐后,保持罐温26。C~32。C,罐压0.5~0.9千帕,搅拌速率120~150转/分,通气量1:0.3~0.5v/v•m,发酵45~55小时,然后转接人发酵罐发酵。
六、发酵培养
(一)发酵培养液的配制
培养液组成按(克/l000毫升)比例配制,葡萄糖2.4克,蛋白胨0.03~0.7克,玉米浆0.5~1.5克,玉米粉0.5~2克,麸皮汁1~3克,磷酸二氢钾0.1~0.5克,硫酸镁0.01—0.2克,按配方称取各种药品,加水定容至所需体积,pH值为4.5~5.0。微微加热,搅拌使药品溶解,然后,将培养液倒入已进行空气过滤器消毒和空罐消毒的发酵罐中,进行实消。
(二)发酵罐的消毒
1.空气过滤器消毒
缓慢打开蒸汽,先排出蒸汽管路凝结水,逐渐打开蒸汽阀门,使蒸汽过滤器压力表指示在0.13~0.14兆帕之间,然后慢慢打开阀门,使蒸汽通过空气过滤器,观察空气过滤器压力表显示,控制在0.11~0.12兆帕之间。过滤器消毒30~50分钟。消毒时,流经空气过滤器的蒸汽压力不得超过O.12兆帕,蒸汽流量也不能太大,否则会损坏空气过滤器滤芯,使其失去过滤功能。然后,打开空气阀门,控制空气流量在1:0.3v/v•m左右,吹干空气过滤器。
2.空消
固定好罐盖螺栓,将接种口、补料口、电极插孔堵塞等紧固。注意:罐盖密封螺栓应对称拧,牢靠即可,不要拧得过紧,防止损坏螺栓和橡胶密封圈。然后排尽夹套内存水,打开罐顶放气阀,排出管路凝结水,向罐体通人蒸汽。使罐压稳定在0.11~0.12兆帕之间,不得超过0.15兆帕,空消30~50分钟。然后关闭蒸汽,打开空气阀门,向罐体通人空气,以保证罐内正压。使罐压维持在0.03~0.05兆帕之间。
3.实消
关闭空气阀门,打开罐顶放气阀,卸去罐内压力。安装好PH、D0电极,倒入配好的种子培养基,补水。培养基灭菌过程中,蒸汽将会带人一定量的凝结水,使灭菌后培养基体积升高,同时考虑接种时种子带入的液体体积,故培养基配制时须相应的减少水的加入量。具体加水量要明确实消过程增加的凝结水量后再调整。然后开始升温,排空夹套内残水,对发酵培养液进行预热。此时可低速搅拌培养液,当温度达到80。C时,停止搅拌。向罐内通人蒸汽加速升温,并对空气进罐管路灭菌。罐温到达灭菌温度后,使罐压保持在0.11~0.12兆帕之间,实消30~40分钟。实消时间不足将无法灭菌彻底,太长会过多地破坏培
养基营养成分。计时结束后,关闭蒸汽,打开空气阀门。开始自然降温减压。保证罐压在0.03—0.05兆帕之间。不得过低,否则极易吸入外界空气造成染菌。
(三)移种
当发酵罐中的发酵液灭菌结束,并降至发酵温度后,就可将种子罐中发酵成熟的种子液移至发酵罐内了。先进行移种管路的灭菌,打开蒸汽通过移种管路,排出凝结水,使少量蒸汽流出即可,计时30分钟。移种管灭菌后,应尽快将种子罐中的种子液移入发酵罐,不要等移种管冷却,否则容易引起染菌。关闭种子罐搅拌,调节种子罐的进、出气口阀门,使种子罐压保持在0.08兆帕左右,调节发酵罐的进、出气口阀门,使发酵罐的罐压保持在0.03兆帕左右。打开移种管阀门,种子罐中的菌种因压力差而自动流人发酵罐内。当种子罐内的菌液全部流入发酵罐后,立即关闭移种管阀门。将移种管路再次灭菌。对种子罐进行清洗。
(四)培养条件
将种子罐中发酵成熟的种子液按l0%接种量接入种子发酵罐后,保持发酵罐罐温26~32。C,罐压0.5~0.9千帕,搅拌速率l20~150转/分,通气量1:0.3~0.5v/v•m,发酵160~200小时,在发酵液还原糖含量降低到1.0%~2.0%左右时为发酵终了,放料。
七、放料
发酵完成后,需将培养液放出,先对放料口灭菌30分钟。关闭搅拌,调节进气阀门,使罐压维持在0.05~0.08兆帕之间,打开放料阀门,弃去最初流出液体后,收集发酵液。关闭气、水路阀门,清洗发酵罐。